【產(chǎn)品名稱】

商品名稱： 禽-流-感病毒通用型（AIV-U）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name： Avian Influenza Virus Detection Kit （Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

禽-流-感是禽類流行型感冒的簡稱，它是由甲型流感病毒的一種亞型(也稱禽-流-感病毒)引起的一種急性傳染病，經(jīng)變異后也能感染人類，被國際獸疫局定為甲類傳染病。禽-流-感病毒(AIV)為正粘病毒科甲型流感病毒屬，單股 負(fù)鏈 RNA 病毒。依據(jù)其外膜血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)蛋白可分為 H 亞型和 N 亞型，目前已發(fā)現(xiàn) 18 個 HA 和 11 個 NA 亞型。

本試劑盒適用于檢測拭子樣品、氣管、肺、腦、腸（包括內(nèi)容物）、肝、脾、腎、心等組織臟器中禽-流-感病   毒 RNA，適用于禽-流-感病毒感染的診斷、檢疫、檢測、監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查等。

【檢驗原理】

本試劑盒針對禽-流-感病毒 M 基因高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對禽-流-感病毒 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格50T/盒

AIV-U 反應(yīng)液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

AIV-U 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

拭子樣品：采集咽喉拭子時將拭子每人喉頭及上顎裂來回刮 2 次~3 次并旋轉(zhuǎn)，取分泌液；采集泄殖腔拭子時將拭子深入泄殖腔至少旋轉(zhuǎn) 3 圈并沾取少量糞便；將采樣后的拭子分別放入盛有 1.2 mL 樣品稀釋液（配制方法見 GB/T 18936-2020 高致病性禽-流-感診斷技術(shù)）的 2 mL 采樣管中，編號并填寫相應(yīng)采樣單。

發(fā)病禽鳥可無菌采集氣管、肺、腦、腸（包括內(nèi)容物）、肝、脾、腎、心等組織臟器，裝入 15 mL 或 50 mL

帶螺口的有機材料保存管中，編號并填寫相應(yīng)采樣單。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

將棉拭子充分捻動、擠干后棄去拭子；糞便，研碎的組織加 PBS 充分研磨，按照 1g 組織加 10 mL PBS 的比例配成懸液。樣品液經(jīng) 3 000 r/min 離心 10 min，取上清作為核酸檢測材料。

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（離心柱法）進行核酸提取，請按照試劑說明書    進行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑AIV-U 反應(yīng)液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL /管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，

短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇：檢測通道（ReporterDye）FAM，淬滅通道

（QuencherDye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle50℃10min否

21 cycle95℃2min否

345 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請參照各儀器使用說明書進行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6.試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. GB/T 18936-2020 高致病性禽-流-感診斷技術(shù)[S].