【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：乙型流感病毒（IBV）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

Name ：Influenza B virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

乙型流感，是由乙(B)型流感病毒引起的流行性感冒，其特點是起病急驟，畏寒、發(fā)熱，體溫在數(shù)小時至 24 小時內(nèi)升達高峰，39-40℃甚至更高。伴頭痛，全身酸痛， 乏力，食欲減退。呼吸道癥狀較輕，咽干喉痛，干咳，可有腹瀉。顏面潮紅，眼結(jié)膜外眥充血，咽部充血，軟腭上有濾泡

本試劑盒適用于檢測的咽拭子、血清和痰等標本中乙型流感病毒 RNA，適用于乙型流感病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對乙型流感病毒特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對乙型流感病毒 RNA 進行體外擴增檢測，用于科研上對可疑感染者的病原學(xué)檢測。

【試劑組成】

名稱規(guī)格

酶液50μL×1 管

IBV 反應(yīng)液1.0mL×1 管

IBV 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

咽拭子：應(yīng)使用與用采樣拭子，適度拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部； 迅 速將拭 子放入 標本采集 管中， 旋 緊管蓋 并密封， 以防干 燥。全血：疑似感染病人的靜脈血 2mL 至 EDTA-2Na 抗凝管，8000rpm 離心 2min，取適量上清液于 1.5mL 滅菌離心管中。痰： 以清晨的第一口痰為宜。先用清水漱口， 囑患者用力咳出深部的痰于無菌樣本保存管，密封，即可送檢。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

取適量樣本于 1.5mL 滅菌離心管中，按 RNA 提取試劑盒說明書進行提取。

1.2RNA 提取

推薦采用公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑IBV 反應(yīng)液酶液

用量20μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇：

檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle42℃20min否

21 cycle95℃10min否

340 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復(fù)試驗，重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。

6.檢測方法的局限性

6.1樣本檢測結(jié)果不樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

6.2樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

6.3陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

6.4病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6.5不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6.6試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

6.7本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7.質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線且無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理。